Introducción
Recientemente tuve una conversación interesante con un colega y amigo sobre la variación en los resultados de las pruebas de un estudio de alimentación con calostro que realizó. En este estudio, mi colega alimentó a los terneros con dos cantidades diferentes de calostro (2 L y 4 L) a las que se les añadió un compuesto (0 o 1 gramo por alimentación) que se esperaba que mejorara la eficacia aparente de absorción de IgG en los terneros. La naturaleza exacta del compuesto no es importante aquí, ya que no está disponible comercialmente y no funcionó de todos modos.
Mi colega (lo llamaremos John) envió sus muestras de calostro y sangre a un laboratorio externo para medir la concentración de IgG del calostro y las muestras de suero de los terneros. Bueno, el laboratorio completó sus pruebas y envió los resultados. Cuando John vio los resultados, no los creyó, ya que los resultados del suero parecían un poco más bajos de lo esperado y las muestras de calostro eran mucho más variables (algunas altas, otras bajas) de lo que esperaba. Entonces, John envió un conjunto de muestras a un segundo laboratorio para su confirmación. Los resultados que obtuvieron solo empeoraron las cosas. Las muestras de suero del segundo laboratorio fueron consistentemente más bajas que las del primer laboratorio y las muestras de calostro fueron mucho más consistentes, ¡pero todas fueron más altas que las del primer laboratorio! Bueno, como puedes imaginar, John estaba confundido y molesto por la variabilidad de los resultados. Esperaba que los resultados de las pruebas fueran todos iguales, y no fue así.
Entonces, ¿qué está pasando? Antes de entrar en los detalles de estos dos laboratorios y lo que hicieron, analicemos un poco sobre las pruebas de inmunoglobulinas y la naturaleza de las pruebas que utilizamos actualmente.
Prueba de inmunoglobulina
Hay varios métodos que se utilizan para medir el contenido de IgG de diversas sustancias. El procedimiento más utilizado se llama inmunodifusión radial (RID). Otros métodos populares incluyen el inmunoensayo turbidimétrico (TIA) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Todos estos estudios se basan en un concepto similar. Es decir, es posible generar anticuerpos contra anticuerpos y utilizar estos anticuerpos generados con fines de diagnóstico. Echemos un vistazo para ver a qué me refiero. En la figura 1, comenzamos con un animal sano, en este caso un ratón. Las cabras, ratas, ratones y caballos son animales de uso común. Las ratas y los ratones son baratos, fáciles de mantener y pueden proporcionarle anti-IgG muy específico, mientras que las cabras y los caballos pueden proporcionar una gran cantidad de suero a bajo costo. A estos animales se les inyectan preparaciones purificadas de anticuerpos de otra especie, en nuestro caso, anticuerpos de vacas. Entonces, si inyectamos al ratón con IgG bovina, después de un período de tiempo, el ratón desarrollará una respuesta inmune (es decir, producirá anticuerpos) a la IgG inyectada. El suero del ratón contendrá entonces IgG anti-bovino de ratón. Luego, podemos recolectar el suero y usar la IgG anti-bovina de ratón en nuestros ensayos.
Cuando mezclamos IgG bovina del suero de nuestros terneros recién nacidos junto con IgG anti-bovino de ratón, los dos anticuerpos deberían reaccionar entre sí. Y, dependiendo de la prueba, podemos usar esta interacción para determinar cuánta IgG bovina hay en nuestros terneros.
La prueba RID es relativamente sencilla, en la que se mezcla anti-IgG bovino con agar (un tipo de gelatina derivada de las algas) y se vierte en placas. Luego se cortan pequeños orificios en las placas y la muestra líquida se coloca en los orificios.
Durante las próximas horas (un RID para medir la IgG tardará unas 24 horas), el suero de ternera se difundirá a través del agar. A medida que la IgG bovina interactúa con la IgG anti-bovina de ratón, formará un precipitado que aparecerá como un círculo blanco turbio alrededor del agujero.
Una descripción de la técnica RID está en: https://www.lib.mcg.edu/edu/esimmuno/ch4/radial.htm. Luego podemos leer el tamaño de los círculos y calcular la cantidad de IgG bovina en la muestra.
El procedimiento TIA utiliza una teoría similar (IgG bovina que interactúa con IgG anti-bovina), pero en un medio líquido en lugar de usar agar. Esto le da a la técnica TIA la ventaja de ser mucho más rápida y puede automatizarse. En lugar de leer los diámetros de los anillos (como se hace con RID), la turbidez (nubosidad) de la solución se puede medir con una máquina, lo que puede aumentar drásticamente la cantidad de muestras que se pueden realizar en un día.
Las técnicas de ELISA son más flexibles y complejas. Hay muchos enfoques diferentes para la técnica ELISA. Tiene muchas ventajas en comparación con otros métodos, incluida la velocidad, la precisión y la capacidad de medir cantidades muy pequeñas de IgG. Es un método más complejo y requiere mayor habilidad técnica y equipo en comparación con las otras técnicas. Por lo tanto, tiende a ser menos utilizado para medir la concentración total de IgG en estudios de suero de terneros.
La investigación
Entonces, volvamos a la investigación. ¿Por qué hubo tanta diferencia entre los dos laboratorios en las concentraciones de calostro y de IgG sérica informadas a John? ¿Cómo reconcilió estas diferencias?
Veamos primero los resultados del calostro. Como recordará, el primer laboratorio informó resultados más bajos y menos consistentes en comparación con el segundo laboratorio. El calostro bovino contiene muchas “cosas” que pueden afectar la forma en que la IgG bovina migra a través del agar en un ensayo RID. Grandes cantidades de grasa, caseína y otros compuestos también pueden afectar el complejo IgG / anti-IgG. Además, cuando se recibe una muestra en el laboratorio, ¿cómo se debe procesar para asegurarse de que los análisis sean correctos? ¿Debe eliminarse la grasa antes del análisis para evitar que interfiera con el ensayo? ¿Debería incluirse para reflejar mejor el contenido de IgG en todo el calostro? Bueno, este fue el quid de la diferencia entre los dos laboratorios. El primer laboratorio recibió las muestras de calostro congeladas, las dejó descongelar a temperatura ambiente, las mezcló (mezclando las fracciones de grasa y proteína del calostro) y colocó una muestra en la placa RID. El segundo laboratorio recibió la muestra, la descongeló y tomó una muestra del líquido de debajo de la capa de grasa. Esto eliminó efectivamente la grasa del análisis. Por lo tanto, los valores del ensayo de IgG fueron más altos, pero se basaron en el contenido libre de grasa del calostro, no en el calostro completo. Para comparar estos valores con precisión, John tendría que conocer la cantidad de grasa en las muestras de calostro y calcular la IgG en todo el calostro.
En 1981, Fleenor y Stott informaron diferencias considerables en los resultados de IgG de muestras de calostro que se procesaron utilizando diferentes métodos. Su recomendación fue que se debería usar calostro entero (no sin grasa ni procesado). Si las muestras deben diluirse (y las muestras de calostro con IgG> 50 g / L generalmente deben diluirse), deben diluirse con una muestra de leche libre de IgG. Las muestras de suero deben diluirse en suero también libre de IgG.
El punto de las diferencias entre los laboratorios es que no existe un único método estándar acordado para medir la IgG en el calostro por RID o TIA. Algunos laboratorios tienen más consistencia cuando eliminan sustancias potencialmente interferentes, mientras que a otros laboratorios les gusta mantener el ensayo lo más simple posible.
Las muestras de suero de IgG también variaron según el laboratorio. John quería comparar los resultados de los dos laboratorios y preparó la Figura 2. Tenga en cuenta que los resultados estaban altamente correlacionados, es decir, a medida que aumentaban los resultados de un laboratorio, también aumentaban los resultados del otro laboratorio. El grado de relación, llamado r2, fue de 0,96, lo que indica que el 96% de la variación en uno se puede explicar por el otro. Esto es excelente e indica, en realidad, que cualquiera de estas pruebas puede predecir con precisión la concentración de IgG en muestras de suero.
La ecuación del gráfico indica que Y = 1.1025X. Esto significa que la medición de RID es constantemente un 10,25% más alta que los resultados estimados por el método TIA. Por ejemplo, si una medida de TIA fue de 10 g / L en el suero del ternero, el ensayo de RID sería 10 x 1.1025 = 11.025 g / L. (NOTA: para una revelación completa para los puristas estadísticos, forcé la intersección a través del origen, lo que redujo el r2 muy ligeramente).
¿Por qué la diferencia de resultados? Es importante recordar que los métodos RID y TIA difieren de manera importante. Los ensayos utilizados por los laboratorios diferían no solo por la técnica, sino también por el anticuerpo utilizado (uno utilizó cabra y otro, caballo). El sistema tampón utilizado en el TIA también era (por supuesto) diferente de la matriz de agar del RID.
Entonces, ¿cuál de estos ensayos es “correcto”, es decir, la IgG sérica es 10 g / L o 11? O, dicho de otra manera, ¿hay suficiente diferencia entre estos ensayos de qué preocuparse? Bueno, si está interesado en declarar si los terneros tienen “FPT” o no, es decir, 10 g / L o más, entonces la diferencia entre el método podría ser significativa. Si calculamos FPT del estudio de John, usando los resultados de RID declaramos que el 35% de los terneros tenían FPT, mientras que el 47% de los terneros tenían FPT si usamos los resultados de TIA. Por otro lado, como productor, la diferencia entre 10 y 11 g de IgG en el suero de un ternero a las 24 horas de edad puede no ser muy significativa.
¿Existe una “mejor” prueba? En mi opinión, no. Cualquiera de los métodos: RID, TIA, ELISA (y algunos otros) puede ser muy exacto y preciso. Aunque el RID se ha considerado durante mucho tiempo el “estándar de oro para las pruebas”, existen varios problemas con el RID y es posible que no sea óptimo en todas las situaciones (por ejemplo, análisis de calostro). Otros métodos, particularmente el TIA, tienen la ventaja de un alto rendimiento con un bajo costo, lo que hace que la medición de IgG a gran escala sea razonable. Varios investigadores han informado que el TIA es tan preciso como el RID para medir las concentraciones séricas de IgG (Davis et al., 2005; Etzel et al., 1997; McCue, 2007).
Algunas recomendaciones sobre la comprensión de los ensayos y el informe de ensayos
Por lo general, será suficiente saber si el laboratorio tiene buena reputación y sigue un procedimiento estándar para los métodos RID, TIA o ELISA. Trabajar con un laboratorio de manera constante puede ayudarlo a minimizar la variación que puede ocurrir entre los laboratorios y las metodologías de prueba. Hable con su personal técnico para asegurarse de que tengan suficiente experiencia en la realización de ensayos y de que dispongan de estándares y métodos de control interno adecuados. Si tiene mucha curiosidad acerca de la repetibilidad de sus pruebas de IgG en suero, puede hacer esto: recolecte suero de varios terneros (o una vaca) para tener 50-100 ml. Mézclalo todo y colócalo en tubos separados que contengan 2-3 ml de suero. Congélalos. De vez en cuando, envíe uno de estos tubos con sus muestras de prueba. Estos resultados (llamados control interno) deben ser razonablemente consistentes (dentro del 10-15%) cada vez. Si estos resultados varían, es hora de ponerse en contacto con el laboratorio.
Si está interesado en obtener más detalles, aquí hay algunas de las cosas que necesitará saber si realmente desea comprender los resultados de IgG de un laboratorio que realiza estos ensayos.
- Manipulación y preparación de muestras
- 1. ¿Qué sucede con las muestras después de su llegada?
- 2. ¿Cuánto tiempo se almacenan?
- 3. ¿Cómo se descongelan?
- 4. Qué tipo de procesamiento previo al ensayo tiene lugar?
Selección de anticuerpos
- 1. ¿En qué animal se crían las IgG anti-bovinas?
- 2. ¿Cuál es la especificidad del anticuerpo?
- 3. ¿El anticuerpo reconoce pocos o múltiples epítopos?
- 4. ¿Es el anticuerpo específico para IgG1, IgG2 o ambos?
IgG assay
- 1. ¿Qué tipo de ensayo se realizó (ELISA, TIA, RID)?
- 2. ¿Cuáles fueron las condiciones (tampones, diluyentes, tiempos, temperaturas)?
- 3. ¿Cómo se leyeron y calcularon las concentraciones?
- 4. ¿Cuáles fueron los estándares utilizados y en qué concentración?
- 5. ¿Cuál fue el CV interensayo y el CV intraensayo??
Línea de fondo
El mensaje para llevar a casa de mi conversación con mi colega fue que los ensayos para medir los parámetros inmunológicos no son tan simples como muchas otras técnicas analíticas. Todavía hay algo de arte en el desarrollo de un buen inmunoensayo y puede haber algunas variaciones de un laboratorio a otro y de un ensayo a otro. Si intentamos analizar las pequeñas diferencias entre los ensayos, es posible que nos decepcione la variación típica de los ensayos y los laboratorios. Le recomendé a John que tomara los resultados de TIA y los resultados de RID y los promediara como resultados “reales”. Esto incorporaría ambos ensayos en un número.
En un entorno de producción, es poco probable que las diferencias entre los ensayos (suponiendo que se realicen correctamente) sean importantes desde el punto de vista de la salud del ternero. Mi recomendación es encontrar un laboratorio que sea económico, que esté dispuesto a trabajar y hablar con usted, que brinde un buen servicio de respuesta y sea consistente. Discuta sus necesidades y no se empantane demasiado en pequeñas diferencias. Como productor, usted está realmente detrás de los terneros que tienen mayor riesgo de contraer enfermedades debido al mal manejo del calostro. Generalmente, estos son los terneros que tendrán concentraciones muy bajas de IgG.
Referencias
Davis, D. G., D.M.W. Schaefer, K. W., Hinchcliff, M. L. Wellman, V. E. Willet, and J. M. Fletcher. 2005. Measurement of serum IgG in foals by radial immunodiffusion and automated turbidimetric immunoassay. J. of Vet. Internal Med. 19:93-96.
Etzel L.R., R. E. Strohbehn and J. K. McVicker JK. 1997. Development of an automated turbidimetric immunoassay for quantification of bovine serum immunoglobulin G. Am. J. Vet. Res. 58:1201-1205.
Fleenor, W. A., and G. H. Stott. 1981. Single radial immunodiffusion analysis for quantitation of colostral immunoglobulin concentration. J. Dairy Sci. 64:740-747.
McCue, P.M. 2007. Evaluation of a turbidimetric immunoassay for measurement of plasma IgG concentration in foals. Am. J. Vet. Res. 68:1005-1009.